PENGARUIT DIET MINYAK IKAN KAYA OMEGA-3 TERHADAP RESPON KEKEBALAN TUBUH DAN UPAYA PENGGUNAAN BOG UNTUK MENGATASI EFEK NEGATIF YANG DITIMBULKANNYA

Abstract

Minyak ikan kaya omega-3 banyak digunakan sebagai suplemen makanan pada orang¬orang tua terutama untuk penderita rcmatoid artritis dan penyakit-penyakit kardiovaskuler. Meskipun ada keuntungannya tetapi dilaporkan juga bahwa penggunaan minyak ikan kaya omega-3 dal= jangka waktu tertentu dapat menunmkan respon imunitas seluler. Disisi lain ada imunostimulator yaitu BCG yang sudah biasa digunakan dan terbukti dapat meningkatkan respon imunitas seluler melalui respon tine I. Penelitian ini berusaha membuktikan adanya perbedaan respon imunitas seluler pada mencit dengan diet minyak ikan yang mendapat vaksinasi BCG dan yang tidak mendapat vaksinasi BCG. Respon imunitas seluler dilihat dari prolifcrasi limfosit, aktivitas makrofag (yang diukur dad jumlah jimlbsit T yang benkatan dengan makrofag dan konsentrasi produksi NO makrofag) serta basil hitung kuman dad organ hepar (cfu/ gram) pada mencit tua yang telah mengalann immunosenescene. Penelitian ini mcrupakan penelitian eksperimental (aboratorik, dengan pendekatan The Post Test — Only Control Groy Design yang menggunakan binatang percobaan sebagai objek penelitian. Sampel penelitian adalah 24 ekor mencit jantan strain BALD/c, urnur 12-13 bulan, dengan bent badan rata-rata 30 gram, yang diperoleh dad Pusat Vetennaria Parma Surabaya. • Sampel dibagi menjadi 4 kelompok percobaan dengan tancangan acak lengkap (Completely Randomized Design), randoinsasi sederhana dilakukan mengunakan komputer. Semua mencit mendapatkan makanan standar. Pada Kelompok Kontrol (K), mencit tidak mendapatkan perlakuan, sedangkan kelompok BCG (BCG) divaksinasi secara intra peritoneal dengan 0,1cc BCG pada hari ke-14 dan ke-24. Kelompok Minyak Ikan (MI) mendapat diet 5% minyak ikan kaya re-3, sedangkan kelompok Minyak Ikan BCG (MB) mendapat diet 5% minyak ikan kaya dan divaksinasi secara intra peritoneal dengan 0,1cc BCG pada hari ke-14 dan ke¬24. Pada had ke-28, semua mencit disuntik secara intravena dengan 104 Listeria monocytogenes hidup yang diperoleh dad Balai Idanotatorium Kesebatan Semarang. Semua mencit dibunuh dengan pembiusan chloroform yang dilanjutkan dengan dislokasi teller pada had ke-33. Hepar mencit diambil secara aseptis untuk penghitungan kuman dalam du/ gram. Penghitungan dilakukan dengan menghitung koloni yang tumbuh pada media blood agar se/dab inkubasi gerusan hepar selama 24 jam. Penggerusan hepar dilakukan dengan render dan dilakukan pengenceran bertingkat menggunakan NaCI 0,9% untuk ditanam dalam media blood agar. Penghitungan kotoni yang turnbult dilakukan dengan menggunakan Colony Counter. Lien juga diambil secara aseptis untuk penghitungan limfoblas dm limfosit. Lien dihancurkan menggunakan pinset. Kemudian dengan menggunakan pipet Pasteur, suspensi sel dipindah ke tabling pemusing. Setelah set-sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6 menit, suspensi se] dipindahkan ke tabling lain dan dipusingkan sel pada kecepatan 200 xg selama 10 menit pada mini 4°C. Pellet yang didapat diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (±25°C) untuk inelisiskan eritrosit, lalu dipusingkan path kecepatan 200 xg selama 10 mend pada suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pellet dicuci 2x dengan RPMI untuk selanjutnya dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4°C. Sel-sel dihitung menggunakan hemacytometer (limfosit/ cc). Sel dengan kepadatan 3 x 107 sel/m1 ciilcultur dalam medium komplit yang terdiri dart RPM' 1640inengandung penisilin (50 INS), streptomycin (50 0g/mi), glutamine (I mM) dan 10% PBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37°C. Teteskan 1 tetes pada object glass, untuk dibuat sediaan hapus, keringkan di udara. Fiksasi dengan metanol. Cat dengan Giemsa. Baca dengan mikroskop cahaya, hitung jumlah limfoblas dart 200 sel (finffosit+limfoblas) pada area hornogen. Pemeriksaan Jumlah Limfosit T yang berikatan dengan makrofag diperoleh dengan mengisolasi makrofag peritoneal maned. Makrofag kemuclian diinkubasi 37°Cselama 2 jam -dalam tabung dengan alas datar yang bawahnya diberi kaca benda. Setelah PEL dipisahkan, makrofag disentrifus 800g dengan suhu 20°C selama 5 menit bersama heat killed Lisleria monocytogenes dan diinkubasi lagi 37°C selama I jam. PEL dicampurkan kembali dengan makrofag setelah dilakukan pencucian kuman menggunakan PBS dan disentrifus 50g selama 4 mend pada suhu 4°C. Setelah itu dilakukan inkubasi 37"Cselama I jam. Kaca benda dapat diambil dan difiksusi dengan metanol untuk selanjutnya dilakukan pengecatan menggunakan Giemsa 20% selama 20 mend. Penghitungan jumlah limfosit T yang berikatan dengan makrofag dilakukan dengan melihat preparat dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000X dan menghitung jumlah limfosit T yang berikatan dengan 100 makrofag. Pemcriksaan produksi NO makrofag diperoleh dengan mengisolasi makrofag peritoneal mencit. Makrofag kemudian diinkubasi pada suhu 37°C, dengan kadar CO2 5% selama 2 jam dalam plate 96 wells dengan pengarnbilan sampel secara triplikat. Setelah diganti medium, makrofag dikultur dalam inkubator path suhu 37°C, dengan kadar CO2 5% selaina 24 jam. Pemeriksaan konsentrasi produksi NO makrofag dilakukan dengan metode Griess dan dibaca menggunakan Automated Alieroplate Reader SCI' TABINSTRUMENS Model 16 570. Dart uji normalitas menggunakan Kohnogorov-Stnirnov didapatk an data dengan distribusi normal. Malta scianjubiya dilakukan uji One Way Anova untuk inelihat adanya perbedaan path keempat kelompok perlakuan. Besamya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis Iebih lanjut dengan Post Hoc Test Bonferroni dan Tanthane. Untuk melihat adanya korelasi masing-masing variabel yang diukur, dianalisis dengan menggunakan uji korelasi Pearson 's product moment, Sanwa analisis sthistik tersebut dilaktikau dengan menggunakan program komputer SPSS 10.05 for windows. Nilai signifikansi pada penelitian ini adalah apabila variabel yang dianalisis memiliki nilai p < 0,05. Dari penelitian ini didapatkan bahwa jusnlalt hitting kuman pada kelompok mencit tua BALB/c dengan diet minyak ikan saja adalah tertinggi, sedangkan jumlah limfosit T yang berikatan dengan makrofag, konsennasi produksi No. dan proliferasi limfosit tereadah serta menunjukkan perbedaan yang signifikan bila dibandingkan dengan kelompok lainnya. Disisi lain, variabel-variabel terscbut tidak berbeda signifikan lerhadap kelompok 13C0 pada kelompok mencit tua BALD/c dengan dim minyak than yang divaksinasi BCG. Sehingga dapat dinyatakan bahwa pengard Minyak Ikan adalah menekan aktivitas kekebalan seluler, dan upaya penggunaan BCG dapat mentinimalkan efek tersebut dengan memperbaiki aktivitas respon seluler meialui peningkatan: proliferasi limfosit, limfosit T yang berikatan dengan makrofag dan produksi NO makrofag. Hal ini diperjelas dengan tingginyn basil hitting kuman organ Itepar kelompok Minyak ikan, sedangkan kelompok Minyak Ikan -t BCG hasilnya berbeda signifikan dibanding kelompok Minyak Ikan saja. Basil penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan informasi dalain penggunaan minyak ikan kaya Omega-3 sebagai makanan tambahan dan memberikan altematif dalam upaya menanggulangi efek negatif berupa penurunan respon imunitas seluler yang ditunjukkan dengan menurunnya kemampuan makrofag sebagai APC. Menurunnya aktivitas makrofag tersebut kemungkinan dapat diatasi dengan pemberian BCG yang mudalt didapatkan dengan harga murah. Karena penelitian ini dilakukan pada hewn coba maka basil penelitian ini dihampkan juga dapat memberikan landasan untuk penelitian lebih lanjut pada manusia Fish oil (rich in omega-3) has been used as a food supplement by elderly. However, some reports mentioned an impairment of cellular immunity when fish oil consumed for certain period, while BCG vaccination may increase it. To highlight the use of fish oil and effort to diminish the cellular immunity impairment, this particular study is designed using old mice as a model. The study is emphasized on the effects of Fish Oil diet and the use of BCG vaccination in cellular immune responses alteration through macrophage activity measurement i.e. bacterial growth (of& gram) in the liver, physical binding of T lymphocytes, NO production and lymphocytes proliferation. The study adapts Laboratory Experimental and Post-Test Only Control Group Design. The 24 male 13ALBA; mice (12-13 months old and average weight 30 grams) are obtained from PUSVETMA = Pusat Veterinaria Farina, Surabaya. All mice are then divided into four groups and receive standard lab diet daily. The first group (control group = C group) receive no other additional treatment, while the second group (BCG group = BCG group) receive intra-peritoneal injection of 0.1 cc BCG at day 14th and 24th. The third group (fish oil group = FO group) receive 5% fish oil rich ca-3 and the fourth group (fish oil +BUG group = FB group) receive 5% fish oil rich o-3 and intra-peritoneal injection of 0.1 cc BCG at day 14" and 2414. Close to the end of study, at day 28th, all groups are intravenously injected with 104 live L. monocylogenes (LDse= 2)(104 bacteria) obtained from Balai Laboratorium Kesehatan Semarang and sacrificed at day 3314. The liver was taken aseptically to measure bacterial growth (cfu/ gram). Liver was grinded and suspense for multi stage dilution in 0,9% NaCI. The suspension was cultivated in blood agar for 24 hours. Colonies those growths on blood agar media were counted by colony counter. The lien was also aseptically taken to measure weight, lymphocytes proliferation, and • lymphocytes/ cc lien suspension. Weight were measured by electronic scale. After grinded by pincet in 0,9 % NaCI, suspension was take into centrifuge tube. Wait for cells cloth for 5-6 minutes and move suspension to another centrifuge tube to centrifuge for 200g, 10 minutes in 4°C temperature. Pellet was resuspensed in 2 nil lysis buffer at 254C and centrifuged for 200g, 10 minutes in 4"C temperature again. Exile supernatant and wash pellet 2 times by RPMI followed by centrifuged for 200g, 10 minutes in 4°C temperature. Cells were count by haernanytometer (lymphocyte/ cc). 3 x 107 cells/ cc were cultured in complete medium (RPM 1640 contained penicillin (50 1.1/m1), streptomycin (50 pg/ml), glutamine (1 niM) and 10% PBS) for 72 hours in CO2 incubator (37°C temperature). Put a drop on object glass and make spreading object. After dry, get methanol fixation and stained by Gieinsa. Read on light microscope by count lymphoblast/ 200 cells. Physical binding of T lymphocytes was count by isolation of mice peritoneal macrophage. Macrophages were incubated for 37°C (2 hours) in the flat base tube with round object glass. After separate PEL (Peritoneal Exudates Lymphocytes), macrophages were centrifuged for 800g; 20°C temperature; 5 minutes include heat killed Listeria monocytagenes. Incubated again for 37°C; 1 hour. Take round object glass and give methanol fixation. Stained by giemsa and count for lymphocyte T binding on 100 macrophages. Macrophage NO production was count by isolation of mice peritoneal macrophage. Macrophages were incubated for 37°C (2 hours) in 96 wells plate (triplicate). After substitute medium, macrophages were cultured for 24 hours in 5% CO incubator; 37°C. Macrophage NO production was measured by Griess method and read by Automated Microplate Reader (SLT LABINSTRUMENS Model 16 570). Within group difference of data were analyzed by One Way ANOVA. Difference between groups was analyzed by Post Hoc Test Benferroni and Tambane. Correlation between variables was analyzed by Pearson's product moment. Analysis supported by computer software SPSS 10.05 for windows. The result was significant if p < 0,05. The results show that there are significant differences in the liver bacterial growth, the physical binding of T lymphocytes, the NO production and lymphocytes proliferation (p<0,05) among the groups The highest number of bacterial growth, the lowest number of physical binding of T lymphocytes, the lowest NO production and lymphocytes proliferation is found in the FO group. In contrast, there are no significant differences on the number of bacterial growth, physical binding of T lymphocytes, and NO production, between FB group and B group (p>0,05). Therefore, it could be concluded that fish oil is immunosuppressive, while additional treatment with BCG can restore immune response through macrophage activation in aged male BALB/c mice.