PENGARUH DIET MINYAK IKAN KAYA OMEGA-3 TERHADAP RESPON KEKEBALAN TUBUH SERTA UPAYA PENGGUNAAN BCG UNTUK MENGATASI EFEK NEGATIF YANG DITIMBULKANNYA

Abstract

Minyak ikan kaya omega-3 bonyak digunakan sebagai suplernen makanan pada orang-orang tua terutatna untuk penderita rematoid artritis dan penyakit-penyakit kardiovaskuler. Meskipun ada keuntungannya tetapi dilaporkan juga bahwa penggunaan minyak ikan kaya omega-3 dalain jangka wnktu tertentu dapat menurunkan respon irnunitas seluler. Disisi lain ada imunostimulator yaitu BCG yang sudah biasa digunakan dan terbukti dapat meningkatkan respon imunitas seluler melalui respon tipe I. Penelitian ini berusaha membuktikan adanya perbedaan respon imunitas seluler pada mencit dengan diet minyak ikan yang mendapat •vaksinasi BCG dan yang tidak mendapat vaksinasi BCG. Pada tahun pertama, respon imunitas seluler dilihat dad proliferasi limfosit, aktivitas makrofag (yang diukur dad jumlah jimfosit T yang berikatan dengan makrofag dan konsentrasi produksi NO makrofag) serta hasil hitung kuman dad organ hepar (cfu/ gram), sedangkan pada tahun kedua dinilai perbedaan konsentrasi IFN-y makrofag, konsentrasi IFN-y limfosit, kemampuan fagositosis makrofag dan survival pada mencit tua yang telah mengalami immunosenescene. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik, dengan pendekatan The Post Test - Only Cont•l Group Design yang menggunakan binatang percobaan sebagai objek penelitian. Sampel penelitian pada tahun kcdua adalah 72 ekor mencit jantan strain BALB/c, umur 12-13 bulan, dengan berat badan rata-rata 30 gram, yang diperoleh dari Pusat Veterinaria Farma Surabaya. Sampel dibagi menjadi 2 bagian besar yaitu untuk penelitian laboratoris sebanyak 24 ekor (seperti dilakukan juga pada penelitian tahun pertama) dan untuk pengamatan survival sebanyak 48 ekor. Masing-masing bagian dibagi menjadi 4 kelompok percobaan dengan rancangan acak lengkap (Completely Randomized Design), randomsasi sederhana dilakukan mengunakan komputer. Semua mencit mendapatkan makanan standar. Pada Kelompok Kontrol (K), mencit tidak rnendapatkan perlakuan, sedangkan kelompok BCG (BCG) divaksinasi secara intra peritoneal dengan 0,1cc BCG pada had ke-14 dan ke-24. Kelompok Minyak Ikan (MI) mendapat diet 5% minyak ikan kaya co-3, sedangkan kelompok Minyak Ikain + BCG (MB) mendapat diet 5% minyak ikan kaya m-3 dan divaksinasi secara intra peritoneal dengan 0,1cc BCG pada hari ke-14 dan ke-24. Pada had ke-28, mencit disuntik secara intravena dengan 104 Listeria monocytogenes hidup sedangkan yang diamati untuk survival disuntik secara intravena dengan 106 Li•teria monocytogenes hidup yang diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Semarang. Mencit dibunuh dengan pembiusan chloroform yang dilanjutkan dengan dislokasi leher pada hari ke-33, sedangkan kelompok survival terus diamati sampai hart ke 28. Hepar mencit diambil secara aseptis untuk penghitungan kuman dalam cfu/ gram. Penghitungan dilakukan dengan menghitung koloni yang tumbuh pada media blood agar setelah inkubasi gerusan hepar selama 24 jam. Penggerusan hepar dilakukan dengan grinder • dan dilakukan pengenceran bertingkat menggunakan NaCI 0,9% untuk ditanam dalam media blood agar. Penghitungan koloni yang tumbuh dilakukan dengan menggunakan Colony Counter. Lien juga diambil secara aseptis untuk penghitungan limfoblas dan limfosit. Lien dihaneurkan rnenggunakan pinset. Kemudian dengan menggunakan pipet Pasteur, suspensi sel dipindah ke tabung pemusing. Setelah sd-sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6 menit, suspensi sel dipindahkan ke tabung lain dan dipusingkan sel pada kecepatan 200 xg selarna 10 menit pada suhu 4°C. Pellet yang didapat diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (-±25°C) untuk melisiskan eritrosit, lalu dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit pada sully 4°C. Supernatan dibuang dan pellet dicuci 2x dengan RPMI untuk selanjutnya dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4°C. Sel-sel dihitung menggunakan hemacytometer (limfosit/ cc) sehingga didapatkan jumlah 3 x 107 wl/ml. Teteskan I tetes pada object glass, untuk dibuat sediaan hapus, keringkan di udara. Fiksasi dengan metanol. Cat dengan Giemsa. Baca dengan mikroskop cahaya, hitung jumlah limfoblas dari 200 sel (limfosit+limfoblas) pada area homogen. Sel dengan kepadatan 3 x 107 sel/ml yang lainnya dikultur dalam medium komplit yang terdiri dari RPM! 1640 mengandung penisilin (50 U/ml), streptomycin (50 ug/m1), glutamine (I mM) dan 10% FBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37°C. Kultur ini dipanen untuk pemeriksaan interferon-y limfosit. Pemeriksaan Jumlah Limfosit T yang berikatan dengan makrofag diperoleh dengan mengisolasi makrofag peritoneal tnencit. Makrofag kemudian diinkubasi 37°Cselama 2 jam dalam tabung dengan alas datar yang bawahnya diberi kaca benda. Setelah PEL dipisahkan, makrofag disentrifus 800g dengan suhu 20°C selama 5 menit bersama heat killed Listeria monocylogenes dan diinkubasi lagi 37°C selama 1 jam. PEL dicampurkan kembali dengan makrofag setelah dilakukan pencucian kuman menggunakan PBS dun disentrifus 50g selama 4 menit pada suhu 4°C. Setelah lin dilakukan inkubasi 37°Cselama 1 jam. Kaca benda dapat diambil dan difiksasi dengan metanol untuk selanjutnya dilakukan pengecatan menggunakan Criemsa 20% selarna 20 menit. Penghitungan jumlah limfosit T yang berikatan dengan makrofag dilakukan dengan melihat preparat dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000X dan menghitung jumlah limfosit T yang berikatan dengan 100 makrofag. Pemeriksaan produksi NO makrofig diperoleh dengan rnengisolasi makrofag peritoneal mencit. Makrofag kemudian diinkubasi pada suhu 37°C, dengan kadar CO2 5% selama 2 jam dalam plate 96 wells dengan pengambilan sampel secara triplikat. Setelah diganti medium, makrofag dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C, dengan kadar CO2 5% selama 24 jam. Pemeriksaan konsentrasi produksi NO makrofag dilakukan dengan metode Griess dan dibaca menggunakan Automated Microplate Reader SLT LABINSTRUMENS Model 16 570. Supernatan kultur ini juga digunakan untuk pemeriksaan interferon-y makrofag dengan metode ELISA 12 ekor mencit/ kelompok penelitian yang disiapkan untuk survival tetap dipelihara selama 4 minggu. Selama pemeliharaan dilakukan pencatatan mencit-mencit yang mati setiap 12 jam. Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik. Dad uji normalitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov didapatkan bahwa data pada tahun pertama berdistribusi normal. Maka selanjutnya dilakukan uji One Way Anova untuk melihat adanya perbedaan pada keempat kelompok perlakuan. Besarnya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis lebib lanjut dengan Post Hoc Test Bonferroni dan Tamhane. Untuk melihat adanya korelasi masing-masing variabel yang diukur, dianalisis dengan menggunakan uji korelasi Pearson's product moment. Dad uji normalitas untuk data tahun kedua didapatkan konsentrasi IFN-y limfosit dan fagositosis makrofag berdistribusi normal, sedangkan konsentrasi IFN-y makrofag tidak. Maka selanjutnya dilakukan uji One Way Anova terhadap konsentrasi IFN-y limfosit dan fagositosis makrofag untuk melihat adanya perbedaan pada keempat kelompok perlakuan. Besarnya perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dianalisis lebih lanjut dengan Post Hoc Test Tamhane. Sedangkan untuk konsentrasi IFN-y•makrofag dianalisis dengan Kruskol-Wallis test, dilanjutkan analisis perbedaan antar kelompok perlakuan yang diuji dengan Mann-Whitney U. Survival antar kelompok perlakuan dihitung dengan metode Kaplan-Meier perbedaan pada 4 kelompok perlakuan diuji dengan log rank statistics.Semua analisis statistik tersebut dilakukan dengan menggunakan program komputer SPSS 10.05 for windows. Nilai signi5kansi pada penelitian ini adalah apabila variabel yang dianalisis memiliki nilai p S 0,05. Dari penelitian ini didapatkan bahwa jumlah hitung kuman pada kelompok meneit tua BALI3/c dengan diet minyak ikan saja adalah tertinggi, sedangkan jumlah lirnfosit T yang berikatan dengan makrofag, konsentrasi produlth NO dan proliferasi limfosit terendah sesta menunjukkan perbedaan yang signifikan bib dibandingkan dengan kelompok lainnya. Disisi lain, variabel-variabel tersebut tidak berbeda signifikan terhadap kelompok BCG pada kelompok inencit tua BALB/c dengan diet minyak ikan yang divaksinasi BCG. Sehingga dapat dinyatakan bahwa pengaruh Minyak Ikan adalah menekan aktivitas kekebalan seluler, dan upaya penggunaan BCG dapat meminimulkan efek tersebut dengan memperbaiki aktivitas respon seluler melalui peningkatan: proliferasi limfosit, limfosit T yang berikatan dengan makrofag dan produksi NO makrofag. Hal ini diperjelas dengan tingginya basil hitting kuman organ hepar kelompok Minyak ikan, sedangkan kelompok Minyak Ilcan -F I3CG hasilnya berbeda signifikan dibanding kelompok Minyak Ikan saki. Pada tahun kedua didapatkan bahwa konsentrasi IFN-y makrofag paling rendah pada kelompok mencit yang mendapat diet minyak ikan dan paling tinggi pada kelompok mencit yang mendapat vaksinasi DCG, kombinasi minyak ikan dengan BCG akan meperbaiki rendahnya konsentrasi IFN-y makrofag yang diakibatkan diet minyak ikan secara signitikan. Disisi bin konsentrasi IFN-y limfosit tidak berbeda secara signifikan. Minyak ikan dapat meningkatkan fluiditas membran sehingga fagositosis makrofag . yang mendapat minyak ikan paling tinggi dibandingkan kelompok lain dan perbedaannya bemmkna bila dibandingkan yang mendapat BCG saja maupun kombinasi minyak ikan+BCG. Meskipun path penelitian ini tidak didapatkan perbedaan survival rate yang signifilcan antar kelompok perlakuan, tetapi paling tingginya survival pada kelompok minyak ikan + BCG tampaknya memberikan harapan bahwa pemberian BCG alum meninglcatkan survival terhadap infeksi dibanding yang mendapat minyak ikan saja atau 13CG saja. Meskipun tidak didukung oleh perbedaaa konsentrasi IFN-y Iimfosit yang menunjukkan pergeseran ke Th1 tetapi tampaknya pertahan tubuk tidak semata-mata oleh peningkatan imunitas seluler melalui jalur Tldi saja, tetapi mungkin ada mekanisme pertahan lain yang belurn diteliti datum penelitian ini, Untuk menyempurnakan konsep pemikiran pada penelitian ini maka masih perlu dilakukan penelitian lanjutan. Penelitian tersebut untuk mengetahui mekanisme lain tersebut yaitu antara lain justni peningkaian IFN-y makrofag akan memacu self T CD8+ untuk melakukan sitolisis dan memacu sel-sel NK untuk melakukan fagositosis. Hasil penelitian ini tampaknya belum bisa dijadikan landasan untuk dilakukannya pengujian pada manusia mengingat masih adanya beherapa mekanisme yang belum diketahui dengan jelas.